DB37T 3405-2018 动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测.doc-汇文网

举报
资源描述
ICS 65.120 B 04       DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3405—2018       动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测 Method for determination of Lactobacillus plantarum in animal microbial feed additives 2018 - 08 - 17发布 2018 - 09 - 17实施 山东省质量技术监督局   发布 DB37/T 3405—2018 前  言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准由主要起草单位:山东农业大学、山东戴尔塔生物工程有限公司、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安市高新区同心共筑生物科技有限公司、济宁市任城区畜牧兽医局、泰安市新众发生物技术有限公司、泰安市圣达富生物技术推广中心、南京福海生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司。 本标准主要起草人:王雪鹏、闫硕、常维山、戴培强、孙杰、张洪喜、王焕高、李福昌、刘建柱、马洪超。 9 动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测 1  范围 本标准规定了饲用微生物添加剂中植物乳杆菌的检验方法。 本标准适用于饲用微生物添加剂和饲料中植物乳杆菌的检测。 2  规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3  术语和定义 下列术语及定义适用于本标准。 3.1  植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 是乳酸菌的一种,厌氧或兼性厌氧。菌体为直或弯的杆状,革兰氏阳性菌。单个、有时成对或成链状排列,最适生长pH 6.2,属于同型发酵乳酸菌。 4  试剂及仪器 4.1  试剂 4.1.1  MRS碳酸钙培养基:见附录中A.1。 4.1.2  厌氧包:商品化厌氧包,根据培养罐容积和厌氧包说明确定用量。 4.1.3  山梨醇发酵管:见附录中A.2。 4.1.4  棉子糖发酵管:见附录中A.2。 4.1.5  甘露醇发酵管:见附录中A.2。 4.1.6  蔗糖发酵管:见附录中A.2。 4.1.7  水杨苷发酵管:见附录中A.2。 4.1.8  纤维二糖发酵管:见附录中A.2。 4.1.9  七叶苷发酵管:见附录中A.3。 4.1.10  革兰氏染色液:见附录中A.4。 4.1.11  硝酸盐培养基、硝酸盐试剂: 见附录中A.5。 4.1.12  明胶培养基:见附录中A.6。 4.1.13  过氧化氢酶检验:见附录中A.7。 4.2  仪器 4.2.1  恒温培养箱:36 ℃1 ℃。 4.2.2  普通冰箱:0 ℃~4 ℃。 4.2.3  恒温水浴锅:46 ℃l ℃。 4.2.4  电炉:温度为可调式。 4.2.5  吸量管:容量分别为1 mL、10 mL、25 mL。 4.2.6  广口瓶或三角瓶:容量为500 mL。 4.2.7  培养皿:直径为90 mm。 4.2.8  试管:18 mm180 mm。 4.2.9  光学显微镜:10100倍。 4.2.10  高压灭菌锅:使用温度为121 ℃。 4.2.11  烘干箱:使用温度为160 ℃。 4.2.12  厌氧培养罐:2 L~10 L。 4.2.13  玻璃珠:直径为4 mm~5 mm。 4.2.14  振荡箱:可调式,振荡频率为0 rpm~200 rpm 。 5  样品准备 5.1  样品的采集 所采样品真实、具有代表性。采样工具,如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等,灭菌后使用。采样数量和方法按照 GB/T 14699.1 执行。 5.2  试样的制备 按照 GB/T 20195 进行试样的制备。 6  操作步骤 6.1  样品稀释 准确称取样品 25.0 g ,加入含有 50 个玻璃珠和 225 mL 生理盐水的 500 mL 灭菌三角瓶中。200 rpm 振荡箱振荡处理 0.5 h~1 h ,即得 1:10 初始稀释液。吸取初始稀释液 1 mL 于含 9 mL 无菌生理盐水试管中,即得 1:100 稀释液。根据样品含菌量,做进一步的十倍系列递增稀释。 6.2  样品接种 选取 3 个适宜的稀释度,吸取 1 mL 6.1 所述稀释液于灭菌培养皿内。每个稀释度移种2个培养皿。注入已预冷至 50 ℃ 的MRS碳酸钙培养基 15 mL 左右,混匀。 6.3  培养 植物乳杆菌计数培养基凝固后,翻转培养皿,置于厌氧培养罐中,放入厌氧包,密封后放入 36 ℃1 ℃ 恒温培养箱内,36 ℃ 培养 48 h~72 h。 6.4  菌落计数 观察菌落形态,选择菌落数30~300的培养皿,计数带有溶钙环的典型菌落。 7  确证试验 7.1  菌落特征 将典型单个菌落在MRS碳酸钙培养基上划线分离,厌氧培养24 h~72 h,观察菌落形态。 7.2  菌体形态 每个培养皿挑取至少 1 个典型的菌落进行革兰氏染色、镜检。革兰氏染色方法见附录A.4。 7.3  生理生化确证试验 挑取典型菌落分别接种麦芽糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、七叶苷、水杨苷、纤维二糖的生化反应管,并进行过氧化氢酶、硝酸盐还原、液化明胶试验。 7.4  确证结果 7.4.1  菌落形态 菌落为乳白色,圆形,不透明,菌落直径 1 mm~3 mm 。菌落周围培养基有透明环,透明环直径 1 mm~3 mm 。 7.4.2  菌体形态 植物乳杆菌应为革兰氏阳性、单个存在的丝状杆菌,无芽孢。 7.4.3  糖发酵试验 植物乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果见表1 。 表1  植物乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果 麦芽糖 甘露醇 山梨醇 棉子糖 蔗糖 七叶苷 水杨苷 纤维二糖 + + + + + + + + 注: + 表示90%以上菌株为阳性。 7.4.4  其他生理生化试验结果 过氧化氢酶阴性、硝酸盐还原阴性、液化明胶阴性。 8  结果计算及表述 菌落计数后,随机挑取5个菌落进行鉴定(见第7章),计数证实为植物乳杆菌的菌落数,计算出该皿内的植物乳杆菌的活菌数,然后乘以稀释倍数即得每克或每毫升样品中植物乳杆菌的活菌数,按式(1)计算: (1) 式中: A——测定的植物乳杆菌菌落数,单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升(CFU/mL); B——植物乳杆菌菌落总数 ; C——5个鉴定的菌落中确认为植物乳杆菌的菌落数; f——稀释倍数 。 注1: 按照 GB/T 8170-2008 数值修约规则计算出的结果保留至两位有效数字,也可以将样品中植物乳杆菌的菌落数记录为1.0~9.9乘以10的指数幂表示。 注2: 报告每克或每毫升样品的植物乳杆菌估计数,单位为CFU/g 或 CFU/mL 。 A A 附 录 A (资料性附录) 试剂 A.1  MRS碳酸钙培养基 A.1.1  成分 见表A.1。 表A.1  MRS碳酸钙培养基成分 成分 规格 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温80 1.0 mL K2HPO47H2O 2.0 g CH2COONa3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO47H2O 0.2 g MnSO44H2O 0.05 g 琼脂粉 20.0 g 碳酸钙 20.0 g pH 6.2 A.1.2  制法 将上述成分加入到 1000 mL 蒸馏水中,加热溶解,调节pH,分装后 121 ℃ 高压灭菌 15 min~20 min 。 A.2  植物乳杆菌糖发酵管 A.2.1  基础成分 见表A.2。 表A.2  植物乳杆菌糖发酵管基础成分 成分 规格 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 吐温80 0.5 mL 表A.2 (续) 成分 规格 琼脂 1.5 g 1.6 % 溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 1000 mL A.2.2  制法 按 0.5 % 加入所需糖类,并分装小试管,121 ℃ 高压灭菌 15 min~20 min 。 A.3  七叶苷发酵管 A.3.1  成分 见表A.3。 表A.3  七叶苷发酵管成分 成分 规格 蛋白胨 5.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 七叶苷 3.0 g 柠檬酸铁 0.5 g 1.6 %溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 100 mL A.3.2  制法 将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121 ℃高压灭菌 15 min~20 min 。 A.4  革兰氏染色液 A.4.1  结晶紫染色液 A.4.1.1  成分 见表A.4。 表A.4  结晶紫染色液成分 成分 规格 结晶紫 1.0 g 95 %乙醇 20 mL 1 %草酸铵水溶液 80 mL A.4.1.2  制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。 A.4.2  革兰氏碘液 A.4.2.1  成分 见表A.5。 表A.5  革兰氏碘液成分 成分 规格 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.4.2.2  制法 将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mL 。 A.4.3  沙黄复染液 A.4.3.1  成分 见表A.6。 表A.6  沙黄复染液成分 成分 规格 沙黄 0.25 g 95 %乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.4.3.2  制法 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 A.4.4  染色法 A.4.4.1  将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1 min ,水洗。 A.4.4.2  滴加革兰氏碘液,作用 1 min ,水洗。 A.4.4.3  滴加 95 % 乙醇脱色,约 15 s~30 s ,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。 A.4.4.4  滴加复染液,复染1 min。水洗、待干、镜检。 A.5  硝酸盐还原 A.5.1  培养基 A.5.1.1  成分 见表A.7 。 表A.7  培养基成分 成分 规格 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 氯化钾 1.0 g 蒸馏水 1000 mL A.5.1.2  制法 溶解各成分于水中,必要时加热。调整PH值,使培养基pH值在 25 ℃ 时为 7.40.2 。分装试管,121 ℃ 高压灭菌 20 min~30 min 。 A.5.2  试剂 见表A.8 。 表A.8  试剂成分 成分 规格 甲液 对氨基苯磺酸 0.5 g 10%乙酸溶液 150 mL 乙液 甲萘胺 0.1 g 蒸馏水 20 mL 10%乙酸溶液 150 mL 二苯胺试剂 二苯胺 0.5 g 蒸馏水 20 mL 浓硫酸 100 mL A.5.3  试验方法 接种菌于上述培养基中,36 ℃1 ℃培养 2 d~4 d。加入甲液和乙液各1滴,观察结果。如溶液变为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性。如无红色出现,可加 1滴~2滴二苯胺试剂,如不呈蓝色,也为硝酸盐还原阳性,呈蓝色则为阴性。 A.6  明胶培养基 A.6.1  基础成分(PH 7.0) 见表A.9。 表A.9  明胶培养基基础成分 成分 规格 蛋白胨 1.0 g 酵母提取物 1.0 g 葡萄糖 0.1 g 盐溶液 4.0 mL 蒸馏水 100 mL A.6.2  盐溶液成分 见表A.10 。 表A.10  盐溶液成分 成分 规格(g) 无水CaCl2 0.2 MgSO47H2O 0.48 K2HPO4 1.0 NaHCO3 10.0 KH2PO4 1.0 NaCl 2.0 注: 将无水CaCl2与MgSO47H2O混合溶解于300 mL蒸馏水中,再加500 mL水,一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。继续搅拌至全部溶解,加200 mL蒸馏水,混合后4 ℃储藏备用。 A.6.3  制法 向拟分装的试管内加入明胶(0.6 g/管),再将上述配制煮沸后的培养基分装其中(5 mL/管)。115 ℃ 高压灭菌 15 min~20 min 。 A.7  过氧化氢酶检验 A.7.1  试剂 3 % 过氧化氢溶液:现用现配。 A.7.2  方法 用接种环挑取固体培养基上典型菌落,置于洁净试管内,滴加 3 % 过氧化氢溶液 2 mL ,观察结果。 30 s 内发生气泡者为阳性,不发生气泡者为阴性。 _________________________________
展开阅读全文
温馨提示:
汇文网-专业的C2C文档交易平台所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
相关搜索

当前位置:首页 > 工程图书 > 未整理